Naam: Miranda Seegers en Anne van der Woude

Naam: Miranda Seegers en Anne van der Woude

Datum uitvoering: 5 en 12 september 2018

Datum verslag: 14 september 2018

Docent: Trusanne Bos

Reductie van Ethylacetoacetaat en immobilisatie van β-galactosidasegalactosidase Samenvatting Het doel van dit experiment was (S)-(+)-Ethyl 3-Hydroxybutanoaat enzymatisch te synthetiseren uit ethylacetoacetaat met behulp van een bakkersgist. Na de synthese is het product gezuiverd met behulp van centrifuge, gevolgd door het toevoegen van een NaCl oplossing waarna het product geëxtraheerd is met MTBE. MTBE werd verwijderd door de rotavap en tot slot nog gezuiverd met behulp van een vacuümdestillatie. Het product is karakteriseert met IR (infrarood) en optische rotatie, ook is de opbrengst bepaald.Tevens is er ook een experiment gedaan met lactose en de immobilisatie van de β-galactosidase. De β-galactosidase werd eerst geïmmobiliseerd door dit op te lossen in Na-alginaat oplossing en toe te druppelen aan 2M CaCl2 zodat er beads ontstonden. De beads zijn aan de lactose oplossing toegevoegd en de omzetting van lactose in glucose werd bijgehouden met behulp van een glucosemeter.Doel Het doel van dit experiment is het reduceren van ethylacetoacetaat met behulp van gistcellen en het omzetten van lactose in glucose met behulp van geïmmobiliseerd B-galactosidase.Inleiding Reductie Bij de reductie van ethylacetoacetaat kunnen er twee structuren ontstaan namelijk S en R ethyl 3- hydroxybutanoaat. Het enzym in de gistel heeft de voorkeur bij de reductie om (S)-(+)-Ethyl 3- Hydroxybutanoaat te maken. Als deze reductie gedaan zou worden zonder enzym zou er een racemisch mengsel ontstaan van R en S Ethyl 3-Hydroxybutanoaat.Immobilisatie Het gebruik van melkproducten is een belangrijk onderdeel van een volwaardige voeding. Ongeveer 70 tot 80% van de volwassen wereldbevolking beschikt echter over een te lage β-galactosidase- activiteit in de darmwand en is lactose-intolerant. Bij lactose-intolerantie wordt lactose niet of onvoldoende afgebroken waardoor het melksuiker begint te gisten in de darmen, wat leidt tot onder andere krampen, gasvorming, buikloop en een opgeblazen gevoel.β-galactosidase wordt commercieel aangemaakt uit allerhande bronnen en industrieel gebruikt voor de productie van lactosevrije melkproducten. Immobilisatie van het enzym is hierbij een interessante technologie in de zuivelindustrie.Recent werd een techniek geoptimaliseerd waarbij β-galactosidase afkomstig van Bacillus stearothermophilus werd gebonden op chitosan met behulp van Tris(hydroxymethyl)-fosfine (THF) (Chen et al., 2009). Haider & Husain (2009) ontwikkelden een andere, relatief eenvoudige methode voor de immobilisatie van β-galactosidase afkomstig van Aspergillus oryzae op het oppervlak van Ca- 1 / 2

alginaat-zetmeel-beads.1 Immobilisatie van β-galactoside heeft als voordeel dat het enzym makkelijk terug te winnen is nadat een reactie is voltooid.Materiaal en methode Methode (S)-(+)-Ethyl 3-Hydroxybutanoaat Eerst is de opstelling gebouwd, zie figuur 1. Vervolgens is er 160 mL kraanwater toegevoegd aan de 1L erlenmeyer. Daarna 29,97 g sucrose en 20,06 g bakkersgist onder constant roeren. Nadat dit werd toegevoegd werd de thermometer in het mengsel gehangen. De temperatuur op de verwarmingsplaat werd verhoogd naar 75°C zodat het reactiemengsel snel de gewenste temperatuur van 30°C bereikte.Toen de gewenste temperatuur bereikt was, werd het mengsel een uur geroerd op 30 °C. Tijdens het uur roeren ontstond er een schuimlaag die zich steeds verder uitbreidde. Na dit uur werd er 2,14 g ethylacetoacetaat toegevoegd onder constant roeren en 30°C. Vervolgens werd er na 1,5 uur nog een keer 2,05 g ethylacetoacetaat toegevoegd aan het mengsel. Dit mengsel heeft een week gestaan.Toen het experiment werd vervolgd is er een monster genomen van het reactiemengsel zodat er een DLC gemaakt kon worden. Vervolgens is het reactiemengsel verdeeld over vier falconbuizen, die na precies afwegen, geplaatst zijn in de centrifuge. De centrifuge heeft op 4000rpm gedraaid voor 10 minuten. Na de 10 minuten werd het gele, heldere supernatant verzameld in een groot bekerglas.Aan het bekerglas werd 20 mL van een verzadigde NaCl oplossing toegevoegd, zodat alle gistcellen gedood werden. Vervolgens werd het mengsel vijf keer gewassen met 50 mL MTBE. De organische laag was wit met (zout)korrels en de waterige laag was helder geel. De verschillende lagen werden in verschillende bekerglazen opgevangen en aan de organische laag werd magnesiumsulfaat toegevoegd. Er werd net zoveel magnesiumsulfaat toegevoegd totdat er geen bellen meer ontstonden in de organische laag. Dit mengsel werd gefiltreerd en vervolgens werd het filtraat aan de rotavap bevestigd. Het waterbad was 40 graden celsius en de druk was 329 bar. Nadat alle MTBE was afgedampt werd de opstelling gebouwd, zie figuur 2. Vervolgens werd het mengsel aan de driehalskolf bevestigd en werden er kooksteentjes toegevoegd. De verwarmingsplaat werd ingesteld op 80 graden celsius en de druk bedroeg 450 bar toen er enige druppels vormden. De opbrengst is bepaald, een IR is gemeten en de optische rotatie is bepaald.

Figuur 1: Opstelling (S)-(+)-Ethyl

3-Hydroxybutanoate

Figuur 2: opstelling vacuümdestillatie

• / 2