Thema 2. Replicatie, transcriptie en translatie

Thema 2. Replicatie, transcriptie en translatie

ZSO1: DNA replicatie en PCR (SBU5)

Leerdoelen -Beschrijven hoe het DNA molecuul is opgebouwd -Uitleggen hoe DNA replicatie verloopt en bijbehorende reacties benoemen en omschrijven -Uitleggen hoe fouten gemaakt tijdens DNA replicatie hersteld worden -PCR uitleggen en beargumenteren of en hoe een gegeven vraagstelling opgelost kan worden met PCR -Aan de hand van een gegeven nucleotide de sequentie van de primers opschrijven nodig voor PCR van DNA Samenvatting Alberts Structuur & functie van DNA

DNA-molecuul: polair van 5' (fosfaat) naar 3' (hydroxyl)

-Suiker-fosfaat backbones draaien elke 10 baseparen rechtsom (dubbele helix)

-Antiparallel: polariteit van beide strengen is tegengesteld georiënteerd

Template streng: complementair aan gesynthetiseerde streng

Coderende streng: hetzelfde als gesynthetiseerde streng

DNA-replicatie

DNA-polymerase 3: polymeriseert nucleotiden bij replicatie

DNA aflezen van 3'5' en maakt van 5'3'

-Leidende streng: direct van 5'3' synthese

-Volgende/lagging streng: okazaki-fragmenten

Replication fork: actieve stuk waar replicatie plaatsvindt

DNA-primase: produceert primer voor DNA-polymerase; maakt korte RNA-primers voor leidende streng met ribonucleoside trifosfaten

DNA-ligase: plakt okazaki-fragmenten aan elkaar

DNA-helicase: verbreekt H-bruggen door ATP-hydrolyse

Single-strand DNA-binding (SSB) proteins: zorgen voor

behoud van geopende DNA-ketens

Sliding ring: houdt bewegend DNA-polymerase bij het DNA

DNA-polymerase 1: vervangt RNA door DNA bij einde

Okazaki-fragment Fouten herstellen 1 / 4

-DNA-polymerase: betere affiniteit met correcte nucleotide dan met incorrecte nucleotide -3'5' proofreading exonuclease: verwijdert ongepaarde/mispaarde residuen aan 3' primer, want transcriptie stopt als er een ongepaard 3'-OH uiteinde aan de primer zit oRNA wordt gemaakt zonder primer; mutaties hebben geen lange-termijn effect Initiatie en completatie van DNA-replicatie

Initiator-eiwitten: binden aan DNA op replication origin en verbreken

de H-bruggen 1.Tijdens menselijke celdeling zijn er 30000-50000 replicatieoorsprongen 2.Verschillende celtypen hebben verschillende soorten oorsprongen 3.Net als in bacteriën worden replicatie-vorken gevormd in paren die in tegengestelde richting bewegen in een replicatie- bubbel Telomerase repliceert chromosoom-uiteinden Laatste RNA-primer van de volgende streng kan niet vervangen worden door DNA, omdat er geen 3'-OH uiteinde is voor de repair polymerase -Telomerase is complementair aan de repeats van telomeren

(mensen: GGGTTA) en vult ze na celdeling weer aan bij de

parent strand, zodat replicatie tot het einde van de DNA- streng kan plaatsvinden -Hoeveelheid en activiteit van telomerase is afhankelijk van het type cel  beschermt tegen kanker - Er moet voorkomen worden dat telomerase hersteld wordt,

-Shelterin: beschermende chromosoomkap die de telomeren 'verbergt'

-T-loops, waardoor het uiteinde verborgen wordt en niet meer aan het uiteinde zit Genen klonen in vitro met PCR 2 / 4

Samenvatting video DNA-replicatie

Primer/template junction: startpunt van de DNA-replicatie

DNA-helicase: ringvormig hexomeer, omcirkelt een DNA-keten, waardoor de ketens uit elkaar geduwd worden. Verschilt per helicase in welke richting ze bewegen.-De strengen blijven uit elkaar door SSP's die binden aan de enkele ketens van de volgende streng; bij de leidende streng gaat de replicatie zo snel dat dit niet nodig is.Sliding DNA clamp: ringvormig molecuul die om dubbelstrengs DNA gaat. Ze binden aan de achterkant van DNA-polymerase, waardoor DNA-polymerase aan de keten gehouden wordt. Ander zouden ze na ongeveer 100 baseparen alweer loslaten van de DNA streng  soort personal trainer Sliding DNA clamp loader: door binding van ATP kan loader binden aan sliding DNA clamp en aan DNA-keten.

• / 4

Vragen a.Chromosomen zijn opgebouwd uit eiwitten (oa. histonen) en DNA. Het DNA bevat de genen b.AATCGGATT Altijd van 5' naar 3'!c.24% T, 26% G, 26% C d.T + G + C = 76% e.Beide oude ketens komen in één van de twee dochtermoleculen. Beide nieuwe moleculen bevatten dus 1 nieuwe en 1 oude keten. Dit is dus semi-conservatief, omdat er 1 keten behouden blijft en 1 keten nieuw gevormd wordt per nieuw DNA-molecuul.Conservatief zou zijn dat de oorspronkelijke dubbelstrengs keten blijft bestaan en een nieuwe dubbelstrengs keten bestaande uit twee nieuwe ketens wordt gesynthetiseerd.f.Bij prokaryoten is er één startpunt, bij eukaryoten zijn er heel veel startpunten (origins of replications) op één DNA-molecuul g.DNA-polymerase h.Primase, DNA polymerase, nuclease om RNA af te breken, ligase i.Dit RNA is een template voor de verlenging van de telomeren Werkgroepopdrachten Vraag 1 -Nee, de pijlen staan niet allemaal de goede kant uit getekend. Replicatie moet plaatsvinden van 5' naar 3' en dit kan dus niet binnen een streng van richting veranderen -2 replicatievorken -De replicatie van het DNA is begonnen bij replication origin. Dit is in het midden van de opengebroken 'ovaal', tussen de 2 vorken -Okazaki-fragmenten -Ja, ligase is nuttig om de okazaki-fragmenten met elkaar te verbinden, zodat er één DNA- streng gevormd wordt Vraag 2 De eerste fosfaatgroep (fosfaatgroep aan de suikergroep), want deze blijft ook na het inbouwen van de nucleotide nog aan de DNA-streng vastzitten. De tweede en derde fosfaatgroep worden verwijdert. De energie die hierbij vrijkomt wordt gebruikt voor de binding van de eerste fosfaatgroep aan de suikergroep van de volgende nucleotide.Vraag 3

a.Radioactieve bouwsteen: 3H-labeled Thymidine (3H-T)

Niet-radioactieve bouwsteen: BrdU (bromodeoxyuridine)

b.Bij toevoeging van deze bouwstenen kan er nog steeds replicatie plaatsvinden, dit proces wordt niet verstoord door de toegevoegde bouwstenen. Het gebruik van bouwstenen is handig, omdat je monoklonale antilichamen kan gebruiken die binden aan deze bouwstenen.Daardoor is het heel makkelijk om de bouwstenen op te sporen.c.Alleen de cellen in de S-fase worden gelabeld. De S-fase is een vrij korte fase dus lang niet alle cellen waren tijdens het kweken in de S-fase. De bouwstenen kunnen alleen in het DNA komen tijdens DNA-replicatie, dus cellen in andere fases zullen niet gelabeld worden.Vraag 4 Het gebeurt aan het uiteinde van een keten, dus het is exonuclease. De fosfaatgroep wordt aan de 5'- kant toegevoegd, dus dan is het 3'-5' exonuclease.Vraag 5

Aantal baseparen mens: 3 miljard = 3.000.000.000

-Lengte Okazaki-fragment: 100-200 bp

-Aantal Okazaki-fragmenten: 3 miljard /150 = 20.000.000 = 20 miljoen Okazaki-fragmenten

• / 4